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MTT檢測試劑盒

MTT檢測試劑盒

產品簡介:MTT檢測試劑盒公司正在出售的產品:人α1微球蛋白/bikunin前體(AMBP)ELISA試劑盒人ELISA試劑盒96T/48T人α2巨球蛋白(α2-MG)ELISA試劑盒人ELISA試劑盒96T/48T人α2抗纖溶酶(α2-AP)ELISA試劑盒 人ELISA試劑盒96T/48T人α2纖溶酶抑制物(α2-PI)ELISA試劑盒人ELISA試劑盒96T/48T

產品型號:

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更新時間:2022-06-20

產品廠地:上海市

詳情介紹
品牌其他品牌貨號LZ-01X6322

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公司產品僅供科研使用,下列是產品屬性:

產品名稱英文名稱規格貨號
MTT檢測試劑盒MTT Assay Kit500次LZ-01X6322

商品介紹:
MTT廣泛用于檢測細胞生長,其原理是MTT可以被活細胞線粒體內的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結晶,而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度,并由此推測出細胞的活力,細胞增殖越旺盛,則吸光度越高;細胞毒性越大,則吸光度越低。
產品特點:
1.采用*的Formazan溶解液,可以充分溶解formazan,減少誤差。
2.背景低,靈敏度高,線性范圍寬,重復性好。
3.本產品為足夠500次(5個96孔細胞培養板)微孔板檢測。
4.可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。

存條件:低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存),有效期一年。
使用方法:
下面操作是檢測細胞毒性的試驗,其他應用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗),操作步驟可以以此為基礎稍作修改即可,故不再贅述。
㈠、接種細胞
1.按常規消化法消化匯合的單層細胞,收集到含血清的培養基中。
2.200g離心5分鐘收集細胞沉淀。
3.用培養基重懸細胞沉淀,制備成單細胞懸浮液并計數。
4.將細胞稀釋到2.5×103個/mL~5×10個/mL之間(需要根據細胞的生長速度決定),如果不知道生長數度,一般可以稀釋到1×10個/mL。
5.將足夠量的細胞懸液轉移到培養皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。
6.用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞,則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養基(總體積為200μL)。注意:一定要把細胞加在孔的正中,否則細胞會聚集在孔的角落處,影響試驗。
7.用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養基。第1 列各孔將作為+培養基-細胞+MTT對照(用于測OD時調零),第12列加培養基的作用是減少邊緣效應對第11 列反應的影響。
8.按常規細胞培養方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天,使細胞進入指數生長期。
㈡、藥物處理
9.用培養基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度,則需要預試驗確定),一般一種藥物需要做3塊平行板。
10.去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養基(不要觸動細胞),保留第1 列和第12列各孔中的培養基。
11.在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養基,這些孔將作為+培養基+細胞-藥物的對照。
12.在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物,每列加入一個濃度的藥物。
13.按常規方法把96孔板繼續放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間,此段時間即為藥物處理細胞的時間,由用戶自己決定。
14.處理結束后去除第2 到第11列(共10列,均含細胞)所有孔中的培養基,并再加入100μL新鮮培養基。
15.每天換培養使細胞數量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。
㈢、存活細胞計數
16.在生長末期,去除第1到第11列各孔中的培養基后,再加入100μL新鮮培養基和10μL溶液A(含MTT成分),用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續培養4-8小時。注意:溶液A在低溫情況下會凝固,使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解,搖勻后使用。MTT有致癌性,一定要帶手套操作。
17.小心吸棄孔內培養基(含溶液A)。由于培養基可能會影響光吸收,最好盡可能去除。
18.每孔加入100μL溶液B,置搖床上低速振蕩10分鐘,使MTT形成的formazan結晶物充分溶解。
19.由于產物不穩定,故需要立即在酶聯免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
?注意:用第1 列各孔(+培養基-細胞+MTT對照)調零。
20.計數同樣處理的各次重復的平均值。
21.以藥物濃度為橫軸,以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大,一般需將其轉化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數據的平均數作為100%),這樣便于計算出IC50,用于各種藥物處理效果的比較。注意:如果測生長曲線,則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現S型,具有促進作用的則斜率加大。

注意事項:
①加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
③按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
④底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
⑤洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
⑦實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
⑧試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
⑨不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

實驗步驟:
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

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操作程序:

注意:最重要的是及時固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC處理,以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外,過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。

1.玻片的處理:一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2.細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養,條件為37℃和5%的CO2,所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。

3.培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定:固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌,干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4.30%H2O2 1份+純甲醇50份混合,室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。

5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型,混勻),37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

6.后固定:消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

7.預雜交:濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體,不洗。

8.雜交——按每張切片20μι雜交液,加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后,蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。

9.雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次;37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色,重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

10.滴加封閉液:37℃30分鐘。甩去多余液體,不洗

11.滴加化鼠抗*:37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC:37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

13.滴加化過氧化物酶:37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

14.DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑A,B,C各一滴,混勻,加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時蘇木素復染,充分水洗。

16.酒精脫水,二甲苯透明,封片。




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